Biokolonner - BioSEC, Identifiera och kvantifiera aggregat och fragment

Den kromatografiska separationen av biomolekyler baserad på molekylernas storlek i lösning är känd som Size Exclusion Chromatography (SEC).
Till skillnad från andra kromatografitekniker, förlitar sig SEC på avsaknad av interaktion mellan analyter och den stationära fasen packad i kolonnen. Detta ger den idealiska lösningen för att separera och analysera intakta proteiner från föroreningar såsom aggregat, hjälpämnen, celldebris och andra föroreningar som härrör från nedbrytning. SEC används därför i stor utsträckning för karakterisering av bioterapeutiska molekyler under både utveckling och tillverkningsfas.

Inom SEC separeras molekylerna från största till minsta i förhållande till deras molekyl vikt. Mycket stora molekyler är uteslutna från den packade bädden och eluerar först, i voiden. Mindre molekyler kan tränga in i porerna till olika grad beroende på deras storlek, de minsta molekylerna diffunderar längst in i porstrukturen och elueras sist.

Shodex BioSEC

Val av kolonn

Proteiner och molekyler som har en diskret molekylvikt, är bäst lämpade för silikabaserade stationära faser. Det är viktigt att komma ihåg att proteiner innehåller många aminosyror med varierande sidokedjefunktionaliteter; sura, basiska, hydrofoba och neutrala/hydrofila. För att förhindra interaktioner som inträffar med silikakolonner, behövs buffertar i den mobila fasen men för mycket kan orsaka hydrofoba interaktioner. Proteiner är relativt små och kompakta jämfört med andra biopolymerer, så 300 Å porstorlek är ett bra initialt test av porstorlek.

SEC-kolonner är oftast större än de som används för andra typer av kromatografi och drivs vid jämförelsevis låga linjära flöden.
Standarddimensionen för SEC-kolonner är 7,8 x 300 mm, och flödet 1,0 mL/min, jämfört med en Reversed Phase-kolonn som vanligvis är 2,1 eller 4,6 x 150 mm och 2-3 gånger högre linjära flödeshastigheter. Detta är inte en effekt kopplad till kolonnstorleken utan på grund av SEC-mekanism som kräver lägre flöden för optimal separation genom transport in och ut ur porerna. Kolonndiametern kan också vara viktig beroende på mängden prov som analyseras. Om endast en begränsad mängd prov finns tillgängligt, är 4,6 mm ID (flöde runt 0,35 mL/min) användbart. SEC ger ingen koncentrationsökning i prover. Därför analyseras proverna med SEC genom större volymer (20-100 µL), ofta vid höga koncentrationer (1-4 mg/mL).
Partikelstorlek är också en viktig faktor vid kolonnval. Mindre partikelstorlek ger mer effektiv separation, men ökar risken för en degradering av proteinet (skjuvning/deformering).

Mobilfas

  • Mobilfas bör innehålla buffert / salt att övervinna joniska interaktioner, men för mycket kan orsaka hydrofoba interaktioner.
  • Blanda färsk mobilfas och använd den snabbt eftersom bakterietillväxten är snabb i utspädd buffert som förvaras i rumstemperatur.
  • Rekommenderad bufferthållbarhet är mindre än 7 dagar (såvida den inte hålls kyld).
  • Filtrera före användning. Partiklar kan härröra från vattnet fast mer sannolikt från buffertsalterna.
  • Hög pH fosfatbuffertar (i synnerhet vid förhöjd temperatur) kan avsevärt minska kolonnens livstid vid användning av silikakolonner.

Kalibrering

När du väl har valt en kolonn, kommer det att vara nödvändigt att konstruera en kalibrering med normerna för ert molekylviktsintervall och mobilfassammansättning. Varje gång du ändrar ditt val av kolonn eller gör ändringar i mobilfasen, måste du upprepa kalibreringen. Kalibreringskurvan erhålls genom att plotta retentionstid mot molekylvikt. Det är särskilt viktigt att välja standarder lämpligt för molekylen av intresse.

Läs mer om standarder för BioSEC

Läs mer om BioSEC under respektive leverantör: